云南二代测序分析

二代测序的操作流程有哪些？

1.DNA提取与质检

· 纯净、足量、质量好的样本DNA是检测成功的基础（可以来源于血浆、新鲜组织等）

2.DNA处理→文库构建

· 得到统一长度区间+有接头的DNA片段

· 步骤：DNA打断→末端修复→片段筛选→加A尾→接头连接→PCR

3.靶向捕获

· 特定区域基因的定向检测

4.上机测序

· 根据通量情况选择测序仪

· 上样后机器完成

5.数据分析

· 初级分析：光强数据（不同荧光标记碱基）→序列信息（AGCT）

· 二级分析 多仪器自带

· 三级分析 vcf文件 可diy 二代测序是一种能够同时对数百万甚至数十个亿DNA片段进行测序的方法。云南二代测序分析

二代测序——转录组测序的应用领域

1、基础生物学研究：可以用于研究生物的发育过程。例如，在胚胎发育过程中，通过转录组测序可以了解不同阶段胚胎细胞中基因的表达变化，揭示胚胎发育的分子机制。还可以用于物种进化研究，比较不同物种间转录组的差异，推断基因表达的进化模式。

2、医学研究和临床诊断：在疾病研究方面，用于寻找疾病相关的生物标志物。例如，在**研究中，通过对比**组织和正常组织的转录组，可以发现一些在**中特异性高表达或低表达的基因，这些基因有望成为**诊断、预后判断的标志物。同时，也可以用于药物研发，通过转录组测序了解药物作用后细胞基因表达的变化，评估药物疗效和毒性。

3、农业和植物学研究：在作物育种中，可以研究不同品种作物在抗逆性（如抗旱、抗寒、抗病）等方面的基因表达差异，为培育优良品种提供理论依据。在植物生长发育研究中，分析植物在不同生长环境和生长阶段的转录组变化，了解植物***等因素对植物生长的调控机制。 北京哪里有二代测序技术二代测序可以边合成边测序吗？

二代测序——转录组测序的实验流程（上）

样本采集和 RNA 提取

样本采集需要考虑研究目的和样本类型。例如，研究**组织的转录组，就要准确获取**组织样本，同时比较好有对应的正常组织作为对照。RNA 提取方法有多种，常用的如 Trizol 法，它可以有效地从细胞或组织中提取总 RNA，包括 mRNA、rRNA 和 tRNA 等。提取后的 RNA 质量至关重要，需要通过琼脂糖凝胶电泳或专门的 RNA 质量检测仪器来评估 RNA 的完整性和纯度。

RNA 质量检测和定量

完整性方面，通常使用 RNA 完整性指数（RIN）来衡量。RIN 值越高（一般认为 RIN > 7 是高质量 RNA），说明 RNA 完整性越好。定量方法主要有紫外分光光度法和荧光定量法。紫外分光光度法可以通过测量 RNA 在 260nm 和 280nm 处的吸光度比值来估计 RNA 纯度，比值在 1.8 - 2.0 之间表示纯度较好。荧光定量法则是使用专门的荧光染料（如 Qubit）来更准确地测量 RNA 浓度。

文库构建

首先要进行mRNA富集，一般使用带有poly-T的磁珠来特异性地捕获mRNA，因为真核生物mRNA的3'端都有poly-A尾巴。然后将mRNA反转录为cDNA，再通过超声或酶切等方法将cDNA片段化，片段大小通常在几百个碱基对左右。之后在片段两端连接上测序接头，经过PCR扩增来增加文库的量，使其达到可以上机测序的要求。

二代测序技术的一些***研究进展②

植物基因组学研究领域 ：

花生四倍体野生种基因组测序：河南农业大学殷冬梅教授团队和上海交通大学韦朝春教授团队联合发布了花生四倍体野生种近乎完整基因组 amon2.0 版本。该研究结合 ONT 超长读段、二代测序和 Hi-C 等多种测序技术，使基因组的连续性、完整性和准确性都得到了显著提高，为花生的遗传驯化和分子育种提供了重要的基因组数据信息资源。

长雄野生稻基因组解析：中科院昆明动物所王文研究组与云南省农科院粮食作物研究所胡凤益研究组等中外机构合作，利用二代测序技术成功组装出高质量的长雄野生稻基因组，并对其与近缘物种的分歧时间、基因的收缩扩张等进行了分析，还鉴定出一批可能影响地下茎以及自交不亲和性状的候选基因及代谢途径，为解析相关分子机制提供了重要线索。 二代测序的原理是什么？

二代测序的优势和劣势分别有哪些？

优势：能够同时得到大量的序列数据，相比于一代测序技术，通量提高了成千上万倍;单条序列成本非常低廉。

劣势：序列读长较短，Illumina平台为250-300bp，454平台也只有500bp左右;由于建库中利用了PCR富集序列，因此有一些含量较少的序列可能无法被大量扩增，造成一些信息的丢失，且PCR过程中有一定概率会引入错配碱基。想要得到准确和长度较长的拼接结果，需要测序的覆盖率较高导致结果错误较多和成本增加。 什么是二代测序技术？海南哪里有二代测序流程

二代测序包括全基因组测序和全外显子测序。云南二代测序分析

二代测序技术在不同人群中的准确性有何差异③

孕妇及胎儿

优势：无创产前筛查（NIPT）是二代测序技术用于孕期胎儿常见染色体非整倍体筛查的应用，对于唐氏综合征、18-三体综合征、13-三体综合征等染色体异常疾病的检测准确率分别能达到95%、85%、75%以上，明显高于传统血清学筛查。

局限性：孕妇外周血中胎儿游离DNA来源于胎盘滋养细胞，可能与胎儿实际情况不一致，导致假阳性。母亲若合并免疫疾病、凝血功能障碍等，会使外周血中游离DNA含量过高，掩盖胎儿来源的游离DNA，造成假阴性510. 云南二代测序分析

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