二代测序——甲基化的作用和检测方法有哪些?
作用
基因表达调控:DNA 甲基化通常与基因沉默有关。例如,在**发生过程中,某些抑*基因的启动子区域(调控基因转录起始的 DNA 序列)可能会发生高甲基化,导致这些基因无法正常表达,从而失去对肿瘤细胞生长的抑制作用。
发育调控:在胚胎发育过程中,DNA 甲基化模式的动态变化对于细胞分化和组织***形成至关重要。不同的细胞类型具有特定的 DNA 甲基化图谱,这些图谱引导细胞向特定的方向分化。
检测方法
亚硫酸盐测序法:这是一种能够精确检测 DNA 甲基化状态的方法。其原理是利用亚硫酸盐处理 DNA,未甲基化的胞嘧啶会被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则保持不变。经过 PCR 扩增和测序后,可以区分甲基化和未甲基化的位点。 二代测序的成本比一代测序高吗?苏州哪里有二代测序
二代测序的优势和劣势分别有哪些?
优势:能够同时得到大量的序列数据,相比于一代测序技术,通量提高了成千上万倍;单条序列成本非常低廉。
劣势:序列读长较短,Illumina平台为250-300bp,454平台也只有500bp左右;由于建库中利用了PCR富集序列,因此有一些含量较少的序列可能无法被大量扩增,造成一些信息的丢失,且PCR过程中有一定概率会引入错配碱基。想要得到准确和长度较长的拼接结果,需要测序的覆盖率较高导致结果错误较多和成本增加。 吉林嘉安健达二代测序价格NGS测序是二代测序吗?
二代测序——基因组测序该测几个G?
1、人类全基因组测序
常规全基因组测序:一般建议测序深度为30X-50X,人类基因组大小约为3G,因此数据量通常在90G-150G左右。这样的测序深度可以较为***地检测到基因组中的各种变异,包括单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(Indel)、结构变异(SV)等,适用于大多数疾病研究、群体遗传学研究以及个体遗传特征分析等。
高深度全基因组测序:对于一些特殊的研究目的,如检测低频变异、体细胞突变等,可能需要更高的测序深度,达到100X甚至更高。此时数据量会相应增加到300G及以上,这种高深度测序能够更灵敏地发现罕见的遗传变异,但成本也会大幅提高。
二代测序的建库步骤⑥
六、文库质量检测
定量检测:使用荧光定量PCR(qPCR)或其他核酸定量方法(如Qubit)来确定文库的浓度。Qubit是一种基于荧光染料与核酸特异性结合的定量方法,它可以准确地测量DNA或RNA的浓度,并且对不同大小的核酸片段有较好的定量准确性。通过定量检测,可以了解文库的产量,为后续的测序上样量提供参考。
片段大小检测:利用琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪(如Agilent2100Bioanalyzer)来检测文库片段大小。琼脂糖凝胶电泳是一种传统的方法,通过将文库样品在琼脂糖凝胶中进行电泳,根据DNA片段在电场中的迁移速度来判断片段大小。生物分析仪则可以提供更精确的片段大小分布和浓度信息,它是基于微流体芯片技术,能够快速、准确地分析文库质量。 二代测序包括全基因组测序和全外显子测序。
二代测序的建库步骤③
三、末端修复和加A尾(以DNA文库为例)
末端修复:经过片段化后的DNA末端可能是不平齐的,有5'-突出端或3'-突出端。末端修复反应可以利用T4DNA聚合酶、Klenow片段等酶,将这些末端补平,使其成为平末端。T4DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,在合适的反应缓冲液和dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)存在下,可以将突出的末端补平。
加A尾:在末端修复后的平末端DNA分子的3'-末端加上一个A碱基。这一步是为了后续连接带有T-突出端的接头做准备,一般使用Klenow片段(3'→5'外切酶活性缺失)在dATP存在下进行加A反应,这样可以使DNA片段能够高效地与带有T-突出端的测序接头连接。 单细胞测序也是二代测序。甘肃二代测序原理
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二代测序——基因组测序该测几个G?②
人类全外显子组测序
人类全外显子组*占基因组的1%-2%,大小约为30M-60M左右,但通常需要较高的测序深度来确保外显子区域的变异检测准确性,一般测序深度在100X-200X之间,数据量大约在3G-12G左右。全外显子组测序主要关注编码蛋白质的外显子区域,能够高效地检测出与疾病相关的基因突变,常用于遗传病的诊断、**基因突变筛查等研究。
动植物基因组测序
常见动植物:对于一些常见的动植物物种,如水稻、小鼠等,其基因组大小与人类基因组相近或更小。全基因组测序时,测序深度一般在10X-30X左右,数据量在30G-90G之间。如果是进行重测序或特定性状相关的研究,测序深度可根据具体情况适当调整。
复杂基因组的动植物:部分动植物的基因组较大且复杂,例如某些鱼类、植物的多倍体物种等,其基因组大小可能达到数G甚至数十G。对于这类物种的全基因组测序,测序深度可能在5X-10X左右,数据量也会因基因组大小而异,从几十G到数百G不等。 苏州哪里有二代测序