细胞上清外泌体circRNA测序

众所周知外泌体是供体细胞分泌出来的胞外囊泡，被受体细胞吸收后起到调控受体细胞功能，这篇综述文章主要讨论了外泌体的生成、生化性质以及作为药物递送载体的潜力。外泌体在比较多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肉瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。外泌体具有脂质双层膜结构，能比较好的保护其包被的物质，且能靶向特定细胞或组织，因此是一种比较好靶向给药系统。外泌体是具有生物活性的脂双层囊泡。细胞上清外泌体circRNA测序

密度梯度离心法根据在蔗糖、碘海醇或碘克沙醇等惰性溶液中的浮力密度将外泌体分成特定的层，目前普遍应用的是蔗糖，这种方法可以成功地将亚细胞成分（例如过氧化物酶体，线粒体和核内体）分离到密度梯度溶液中的不同层中。样品被放置在梯度的顶部，当施加离心力时，样品中的颗粒以独特的速率通过梯度，该梯度以从上到下的密度增加。样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集，随后可以通过分馏收集，密度梯度超速离心对从蛋白质聚集体和非膜颗粒中分离出外泌体非常有效。此方法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐、费时且会造成外泌体损失。血清提取试剂盒方法在研究和评估外泌体的副作用和功效时，必须考虑到肉瘤细胞来源的外泌体可能增强肉瘤生长的潜在风险。

酶联免疫吸附测定（ELISA）：将其中一种针对外泌体表面抗原的抗体固定在微孔板的表面上，将外泌体样品暴露于含有固定抗体的孔中，由于抗体-抗原相互作用，表达抗原的外泌体将被捕获固定在板上。将未捕获的样品内容物洗掉，并使用另一种抗体检测固定的外泌体。ELISA已用于从尿液、血浆和血清中分离出外泌体，当使用标准液（已知外泌体的量）创建标准曲线时，甚至可以进行定量。但是，此方法需要通过超速离心或超滤对样品进行预处理。同样，流场-流分离与紫外线分析仪和光散射检测器相结合已被用于分析外泌体的大小和纯度。

近年来，外泌体的捕获技术越来越多，微流体系也被用于外泌体提取，此方法能根据其物理和生化特性同时分离外泌体。采用这种方法获得的样品纯度高，且可及时获取外泌体用于疾病的相关检测。在初次注射时外泌体粘附在微流控设备的内表面，并在随后的PBS注射中冲洗掉。此方法采用的设备复杂，所需的样本量取决于流动通道的长度。另外，样品量的注入速率比较低，因此，对于大样品量，将需要较长的处理时间。外泌体在包括瘤子在内的各种疾病的发病机理中具有重要的功能。目前，研究人员已开发了多种方法来分离外泌体，离心技术仍然是常用方法，其他方法，例如过滤、磁珠分离和色谱法等，也显示出独特的优势，但目前仍然没有一种公认有效的提取方法，研究人员应针对不同来源的样本以及不同的下游分析选取较适宜的提取方案。外泌体较有用的特性之一是它们穿过屏障（如细胞质膜和血/脑屏障）的能力。

磁珠免疫法分离外泌体：将针对目的抗原的抗体通过生物素-链霉亲和素连接到磁珠表面，然后将磁珠与样品共孵育，使外泌体特异性结合到磁珠上形成磁珠-外泌体复合物，再用蒸馏水或者PBS冲洗，结尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脱获得外泌体。该方法相对于ELISA的好处主要是，珠粒提供了更大的表面积来捕获外泌体，从而提高了分离效率。此外，使用磁珠时，样品起始体积没有上限，而基于微孔板的ELISA分析的较大样品体积为100μL，且ELISA洗脱杂质时容易造成孔间交叉污染。当将磁珠法与金标准外泌体分离方法进行比较时，磁珠法可分离出更纯净的外泌体，特异性高、速度更快，并且不需要昂贵的仪器。另外，与其他分离方法（如超速离心或超滤）相比，磁珠法不影响外泌体形态。但是采用磁珠法时，外泌体生物活性易受PH和盐浓度影响。外泌体的提取的方式：超速离心法。人民网外泌体

外泌体鉴定方法从物理特征到表面分子标志物，多角度进行鉴定。细胞上清外泌体circRNA测序

外泌体（Exosomes）是细胞分泌到胞外的一种囊泡（ExtracellularVesicles，EVs），其大小为30-150nm，具有双层膜结构和茶托状形态，含有丰富的内含物（包括核酸、蛋白和脂质等），参与细胞间的分子传递。外泌体普遍存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、唾液、尿液、乳汁等，同时也存在于组织样本中，如脑组织、肌肉组织、脂肪组织等。脑组织分离方法简述：将脑组织剪成薄片，放入离心管中加上消化液进行消化，经水浴、反复轻轻上下颠倒，再用移液间断缓慢吹吸至消化结束。随后加入培养基于消化液中，混匀，置于冰上。再进行一系列的差速超速离心过程，包括除杂、滤膜过滤、超离等。结尾用PBS重悬外泌体，用重悬后的外泌体进行下面的透射电镜（TEM）、纳米粒径追踪分子（NTA）和markerWB鉴定。细胞上清外泌体circRNA测序

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