MAT法热原检测中，非内毒素热原（NEP）对照品设为 “选做”，且试剂盒不默认配备，需结合检测需求灵活使用，背后有明确的设置逻辑。首先，试剂盒开发阶段已通过验证（用多种 NEP 配体刺激细胞），证明其可检出 NEP，后期实验是否加入 NEP 对照，只需根据内部管理要求或专业人员建议确定，无需强制设置；若产品产线明确无 NEP 污染风险（如只使用革兰氏阴性菌原料），可删除 NEP 对照，简化操作。其次，试剂盒不配备 NEP 对照品，是因不同用户需求差异大 —— 部分用户需检测特定 NEP（如脂磷壁酸），部分需检测广谱 NEP，因此提供单独购买选项，用户可按需选择，避免资源浪费。NEP 对照品的主要使用场景包括：一是方法验证阶段，用于确认试剂盒对 NEP 的响应性；二是产品工艺变更后，排查是否引入 NEP 污染；三是欧盟申报时，需证明方法可覆盖 NEP，此时需加入 NEP 对照品并显示阳性结果。若样品检测中 NEP 对照品阳性，而样品检测阴性，可排除 NEP 污染；若样品阳性，则需进一步鉴定热原类型。
热原检测采用人外周血单核细胞（PBMC），优势是天然受体谱系完整，但供体差异导致变异系数（CV）高达25%。黑龙江热原检测规范
基于单核细胞系的稳定性，MAT 热原检测可将复孔数从药典要求的≥4 降至≥3。PyroSHENTEK®热原检测试剂盒数据显示，单核细胞系标曲的 4 复孔与 3 复孔，各浓度点（0.0125-1.0EU/mL）的准确度（相对偏差）与精密度均在标准范围内，无明显差异。这一调整的主要依据是单核细胞系消除了 PBMC 的异质性，无需依赖多复孔抵消波动，既能满足热原检测的稳定性与统计学合理性要求，又能减少试剂与耗材消耗，降低检测成本，同时提升实验效率。因此样品预测试时可选择3复孔进行初步检测，产品放行还需按照药典要求进行4复孔测试。
黑龙江热原检测规范热原检测历经动物整体试验、体外生化反应到细胞免疫应答的三阶段演进，灵敏度与效率不断提升。
MAT 法热原检测背景值偏高会干扰结果判读，需从试剂、操作两方面解决。试剂相关问题中，非特异性活化（如试剂含微量热原）会导致细胞异常分泌 IL-6，需选用低内毒素的试剂与耗材；检测试剂添加过多（如抗体浓度过高）会增加非特异性结合，需按说明书稀释试剂或降低推荐浓度。操作环节问题更多见：孔洗涤不充分会残留未结合抗体与酶，需按方案完成规定洗涤次数（如 3-5 次），确保洗涤液充分浸润孔底；洗涤缓冲液污染（如滋生微生物）会引入外源信号，需现配现用缓冲液；加终止液后读板延迟（超 10 分钟），会因黄色产物降解导致背景虚高，需加终止液后立即读板；底物孵育时见光会引发非特异性显色，需在避光环境下进行 TMB 孵育；孔板底部脏（如残留指纹、液体痕迹）会影响光吸收，需用无尘纸清洁孔板底部后再读板。通过以上措施，可有效降低背景值，确保检测信号的真实性，避免因背景干扰导致热原浓度误判。
一次合格的 MAT 法热原检测，需同时满足 “合格标曲” 与 “合格样品检测值及回收率” 两大关键条件。合格标曲需具备四要素：一是良好线性，采用 4-Parameter Logistic 拟合，R² 需接近 1.0，避免线性不佳导致定量偏差；二是良好信号值，各浓度点 OD 值需呈梯度变化，高浓度点 OD 值需足够（如上限浓度 OD600 达 1.0 左右），信号过低会影响灵敏度；三是良好 CV，复孔间 CV 需控制在合理范围（定量限内≤25%、定量上下限≤30%），确保重复性；四是良好背景值，阴性对照 OD 值需低于标曲下限浓度点 10%，排除外源污染。合格样品检测值则需满足加标回收率在 50%-200%，例如文档中某样品 10 倍稀释回收率 41.3%（不合格），20 倍 71.3%（接近合格），40 倍 97.7%（合格），需在 MVD 范围内调整稀释倍数，同时样品热原浓度需低于规定限值（CLC），方可判定样品符合要求。
当热原侵入人体循环系统，单核细胞表面的TLR即刻化身分子雷达，准确捕获LPS、LTA等外源致热物。
在 MAT 热原检测中，单核细胞系与 PBMC（外周血单个核细胞）的检测结果稳定性差异明显。实验结果数据显示，单核细胞系的标曲 R² 达 1.000，各浓度点 CV 值极低（如 ST1 为 0.92%、ST2 为 1.5%），相对偏差均在 5% 以内；而 PBMC 的标曲 R² 为 0.997，部分浓度点 CV 值超 20%（如 ST2 为 39.6%、ST6 为 45.5%），相对偏差高达 171.43%。这种差异源于两者对热原反应的一致性—单核细胞系能稳定释放 IL-6，PBMC 则因供体差异导致 IL-6 释放水平波动，直接影响热原检测结果的重复性，单核细胞系更适配准确的热原定量需求。
通过加标回收实验，热原检测MAT法验证了对LTA、酵母多糖等非内毒素热原的检出能力。江苏医疗器械热原检测方法验证
湖州申科 MAT法热原检测试剂盒细胞复融后可直接使用，无需离心复苏，24 小时内出检测结果。黑龙江热原检测规范
在单核细胞活化试验（MAT）的热原检测中，IL-6 被确定为关键检测指标，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在稳定性、生物学关联性及商业化应用上的优势。从稳定性来看，IL-6 在体外培养环境中受个体免疫状态影响较小，半衰期更长，实验重复性更优，且检测灵敏度高，能准确定量热原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 产生时间短、表达量低，还易被蛋白酶降解，导致检测信号波动大，难以标准化。从生物学特性而言，IL-6 是先天免疫反应的炎症介质，可通过活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驱动急性期反应，如诱导大脑产生前列腺素 E2（PGE2）触发发热，与热原的致热机制直接关联，是公认的发热标志物。同时，MAT 法热原检测会辅以 IL-1β 和 TNF-α 监测 ——IL-1β 反映单核细胞活化程度，TNF-α 提示炎症放大效应，形成多因子协同体系。此外，IL-6 的 ELISA 试剂盒市场成熟度高、跨平台兼容性强，而 IL-1β 和 TNF-α 的检测方法在灵敏度和标准化上仍有局限，进一步奠定了 IL-6 的重要地位。
黑龙江热原检测规范
