河南热原检测操作步骤

生物制品（如单克隆抗体、重组蛋白、细胞因子）因基质成分复杂（含高浓度蛋白质、螯合剂、表面活性剂、缓冲盐等），在热原检测过程中易出现“反应抑制”或“非特异性增强”现象，严重影响检测结果准确性。选择抗干扰能力更强的检测方法至关重要，重组级联试剂（rCR）因采用完整级联反应路径，抗干扰性优于天然 LAL；单核细胞活化反应测定（MAT）对复杂基质耐受性更高，通过适当稀释即可消除多数干扰，因此生物制品热原检测常采用 “rCR 法（内毒素定量）+ MAT 法（全热原筛查）” 的联合方案，既保证内毒素检测的准确性，又防控非内毒素热原风险。

单核细胞系凭借标准化、可控性等优势，有效解决PBMC（外周血单个核细胞）在热原检测中的局限。其一，单核细胞系源自永生化细胞株（如 Mono-Mac-6），经筛选后细胞特性高度均一，消除供体差异，让热原检测结果稳定性大幅提升。其二，其培养过程可控，培养基配方与环境（温度、CO₂浓度）可准确调控，能维持细胞好的活性，避免 PBMC 因分选、冻存导致的活性衰减。其三，对培养环境波动耐受性更强，可保障细胞遗传稳定且无污染物风险，降低热原检测的操作复杂度与误差率。

PyroSHENTEK^®热原检测试剂盒（MAT法）已完成 25 个品种样品的检测验证，覆盖单抗类、疫苗类、基因工程类、血液制品类、生化药品类与注射液，结果显示其适配性范围广但需关注部分样品的干扰。疫苗类（如麻腮风联合减毒活疫苗、人用狂犬病疫苗）、基因工程类（重组人促红素、干扰素 α-2b）、血液制品类（人血白蛋白、凝血因子 Ⅷ）与注射液（生理盐水、琥珀酰明胶）的加标回收率均在 50%-200% 范围内，无明显干扰，检测结果可靠。单抗类（如贝伐珠单抗、阿达木单抗）、中药注射液等样品虽存在不同程度的抑制作用，需通过提高稀释倍数（如稀释至 MVD 上限）、超声处理或添加中和剂消除抑制，优化后回收率均可达标。此外，MAT 法可有效检测非内毒素热原，如对贝伐珠单抗注射液中添加的酵母多糖（Zymosan，200μg/mL）、脂磷壁酸（LTA，10μg/mL），回收率分别达 113%、66.8%，证明其可解决传统鲎试剂漏检非内毒素热原的问题，尤其适用于高风险生物制品的热原防控。

含消除炎症成分的样品可能抑制 IL-6 产生，需通过科学评估排除干扰，确保 MAT 法热原检测结果准确。根据药典要求，若样品能抑制单核细胞促炎症因子释放，需通过以下步骤验证适用性：首先，选择样品 A、2A、4A 倍稀释（均不超过上限有效稀释倍数 MVD），避免高浓度消除炎症成分过度抑制；其次，进行供试品加标回收率实验，若回收率在 50%-200% 的合格范围，说明消除炎症成分未影响热原检测；再对比 “供试品配制的标曲” 与 “稀释液配制的标曲”，若两者 IL-6 检测值相差在 ±20% 以内，表明样品基质对检测无系统性干扰。例如，某消除炎症单抗样品经 2 倍稀释后，加标回收率达 120%，两种标曲 IL-6 值相差 15%，判定可适用 MAT 法。若出现回收率偏低（<50%），可尝试增加稀释倍数（如 8A 倍）或采用热灭活（若样品耐热）去除消除炎症活性；若仍无法排除干扰，需结合家兔法进行对比验证，避免因消除炎症成分导致假阴性。

MAT 法热原检测标曲采用非倍比稀释，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀释，主要优势在于提升标曲准确性与适用性，避免稀释误差影响。一是可密集覆盖关键浓度区间：热原检测的重点关注区为低浓度拐点（如 0.0125-0.1EU/mL）与高浓度平台区（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀释可在这些区间设置更多浓度点（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲线拟合精度，而倍比稀释低浓度点少，易导致低浓度热原定量不准。二是降低稀释误差累积：倍比稀释需连续稀释（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步误差会累积，导致低浓度点实际浓度偏离理论值；非倍比稀释通过单独配制每个浓度点（如直接用标准品配制 0.025EU/mL），避免误差累积，提升标曲可靠性。三是适配不同样品浓度：非倍比稀释可根据样品预期浓度调整标曲范围，如样品预期浓度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 点，确保样品浓度落在标曲线性区，而倍比稀释范围固定，灵活性差。这些优势使非倍比稀释成为 MAT 法标曲配制的优先选择方式。

MAT 法热原检测的稳定性需从细胞、试剂、操作、样品四维度严格把控。细胞层面，细胞活性与纯度直接决定热原响应能力，活性不足会减少炎症因子分泌，纯度低则引入杂细胞干扰；细胞批次间一致性也关键，TLR 受体表达、倍增时间差异会导致结果波动。试剂与耗材方面，标准品效价需溯源国际标准，避免降解影响标曲；试剂盒中细胞因子需质控，防止外源热原污染；培养液、缓冲液及无热原耗材（吸头、西林瓶）若热原控制不当，易引发假阳性。操作上，加样手法要统一（如 8 通道移液器液面一致），孵育需 37℃、5% CO₂稳定环境，试剂配制浓度准确，设备（酶标仪、洗板机）定期校准，操作偏差会直接导致异常。样品层面，自身干扰物质（消除炎症成分、高盐）、pH 偏离 6-8 或微生物污染，会抑制细胞活化或引入外源热原，需针对性预处理。