江苏化学制药热原检测合规申报

MAT 法热原检测标曲采用非倍比稀释，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀释，主要优势在于提升标曲准确性与适用性，避免稀释误差影响。一是可密集覆盖关键浓度区间：热原检测的重点关注区为低浓度拐点（如 0.0125-0.1EU/mL）与高浓度平台区（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀释可在这些区间设置更多浓度点（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲线拟合精度，而倍比稀释低浓度点少，易导致低浓度热原定量不准。二是降低稀释误差累积：倍比稀释需连续稀释（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步误差会累积，导致低浓度点实际浓度偏离理论值；非倍比稀释通过单独配制每个浓度点（如直接用标准品配制 0.025EU/mL），避免误差累积，提升标曲可靠性。三是适配不同样品浓度：非倍比稀释可根据样品预期浓度调整标曲范围，如样品预期浓度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 点，确保样品浓度落在标曲线性区，而倍比稀释范围固定，灵活性差。这些优势使非倍比稀释成为 MAT 法标曲配制的优先选择方式。

MAT 法热原检测的关键机制是 “热原活化单核细胞 TLR 受体，触发炎症因子分泌”，TLR 受体的全覆盖是保障检测无遗漏的关键。不同热原需活化不同 TLR 受体：最常见的内毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革兰氏阳性菌的非内毒素热原（如脂磷壁酸）需活化 TLR2/6，真菌多糖活化 TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 试剂盒配套细胞需具备全覆盖的 TLR 受体表达—湖州申科生物通过 Western blot 验证，其 HL-60 细胞系表达 TLR1-TLR9，可响应各类热原。为进一步验证覆盖能力，申科用不同非内毒素热原配体（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激细胞，结果显示所有配体均能诱导 IL-6 分泌，且呈良好量效关系，证明试剂盒可检出各类热原。若细胞 TLR 受体覆盖不全（如缺失 TLR2），则无法检测革兰氏阳性菌的非内毒素热原，导致漏检风险，因此 TLR 受体的全覆盖是 MAT 法热原检测的关键技术指标之一。

湖州申科生物MAT试剂盒配套的即用型细胞，需严格遵循解冻与使用规范，避免细胞活性下降影响热原检测结果。首先，解冻操作需快速：从液氮罐或 - 80℃冰箱取出细胞后，立即放入 37℃水浴锅快速解冻（约 1-2 分钟），避免缓慢解冻导致细胞内形成冰晶，损伤细胞膜；解冻后需立即取出，用 75% 酒精擦拭管外壁消毒，防止污染。其次，细胞解冻后需一次性使用完毕，不建议按量添加培养基或添加剂后分次使用—即用型细胞经工艺优化，活性与浓度已预调，分次使用会导致细胞状态不均（如部分细胞活化、部分休眠），影响热原反应性。使用时需严格按说明书操作：将解冻后的细胞直接加入含样品的微孔板中，无需额外洗涤或稀释，若样品为高浓度基质，可提前用无热原培养基稀释样品（不超 MVD），但细胞不可稀释。此外，解冻后的细胞需在 30 分钟内完成加样，避免室温放置过久导致细胞活性下降，若无法及时加样，需置于 37℃培养箱暂存，但不超过 1 小时，确保细胞用于热原检测时处于较好的活性状态。

生物制品（如单克隆抗体、重组蛋白、细胞因子）因基质成分复杂（含高浓度蛋白质、螯合剂、表面活性剂、缓冲盐等），在热原检测过程中易出现“反应抑制”或“非特异性增强”现象，严重影响检测结果准确性。选择抗干扰能力更强的检测方法至关重要，重组级联试剂（rCR）因采用完整级联反应路径，抗干扰性优于天然 LAL；单核细胞活化反应测定（MAT）对复杂基质耐受性更高，通过适当稀释即可消除多数干扰，因此生物制品热原检测常采用 “rCR 法（内毒素定量）+ MAT 法（全热原筛查）” 的联合方案，既保证内毒素检测的准确性，又防控非内毒素热原风险。

MAT 法热原检测中，细胞传代的代次控制是保障检测稳定性的关键，需结合细胞特性与文献数据制定标准。参考行业文献，单核细胞系（如 HL-60、THP1）的使用代次通常不超过 20 代，代次过高会导致细胞生物学特性改变：一是 TLR 受体表达下降，如 TLR4 表达量在 20 代后下降 40%，导致内毒素检测灵敏度降低；二是细胞倍增时间延长，从 24 小时延长至 36 小时，影响共培养时长的准确性；三是炎症因子分泌减少，IL-6 分泌量在 20 代后下降 35%，导致热原浓度低估。申科对配套的 HL-60 细胞系进行代次稳定性验证，结果显示：1-15 代细胞的热原响应性一致（加标回收率 85%-125%），16-20 代回收率波动至 70%-130%，21 代后回收率 < 70%，因此建议控制在 1-15 代使用。实验室需建立细胞代次记录制度，每传代 1 次记录代次，达到 15 代后及时更换新批次细胞，并验证新批次细胞与旧批次的一致性（如检测同一样品，结果偏差≤20%），确保不同代次细胞的检测结果稳定。

PyroSHENTEK^®热原检测试剂盒突破传统检测方法局限，不仅能检测革兰氏阴性菌来源的内毒素，还可准确识别革兰氏阳性菌（脂磷壁酸 LTA）、病毒、真菌等产生的非内毒素热原（NEP），契合热原检测 “全风险覆盖” 的法规需求。其定量限低至 0.025EU/mL，实验数据显示，对 Flagellin、LTA、Resiquimod、Poly-IC 等多种 NEP 均能有效检出，且加标回收率稳定在 50%-200% 合格范围（如贝伐珠单抗注射液中 LTA 加标回收率 66.8%、Zysoman 加标回收率 113%）。此外，试剂盒联合了国内相关机构完成室间验证，与传统家兔热原试验（RPT）桥接结果高度一致 —— 如人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）中 LPS 加标回收率 152.1%、人血白蛋白中 LPS 加标回收率 71.6%，检测数据科学性符合国际法规要求，助力企业无缝衔接中美欧等地申报标准。