上海工艺特异型宿主细胞蛋白（HCP）残留检测试剂盒

宿主细胞蛋白残留检测抗体覆盖率评估：法规推荐的方法有两大类：一类是传统2D-WB法，另一类是基于抗体亲和的免疫捕获类方法。传统2D-WB法存在需要蛋白变性，样品需要前处理（破坏蛋白天然表位）；转膜效率低；易产生非特异性等缺陷，难以反映真实的覆盖率水平。湖州申科自主开发了免疫磁珠捕获分离技术（immunomagnetic beads separation，IMBS)，利用免疫磁珠的半液态性质，可以在悬浮的条件下与HCP样本充分混匀结合，整个过程蛋白无需变性，结合方式与ELISA检测条件相似，可以获得更真实的覆盖率结果。

宿主细胞蛋白残留检测抗体覆盖率评估实验操作复杂，需要在建立实验方法阶段对关键步骤进行充分的验证，以证明实验方法的稳健性。湖州申科开发的基于磁珠捕获的IMBS方法（immunomagnetic beads separation），在开发过程中对关键步骤进行了充分验证,相关结果经过专业评审，验证的内容如下（部分）：①方法优化：针对磁珠与抗体的偶联比例、洗涤液体积、洗涤次数、洗脱次数等关键参数进行优化验证，以保证方法的稳健性；②过程质控：二维电泳存在实验步骤多，时间跨度长，中间步骤难以控制等缺陷，因此在等电聚焦实验部分设计了荧光标记多肽，可快速判断等电聚焦效果。在SDS-PAGE电泳的两侧增加40 ng银染质控，用于银染显色的控制；③方法重复性：针对2D分析以及LC-MS分析进行重复性确认，其中2D分析方法重复性可达到80%以上，LC-MS分析方法可到90%以上；④上样量优化：针对2D分析以及LC-MS分析进行上样量确认，消除上样量差异对检测结果带来的影响；⑤假阳性：排除样品与阴性抗体之间是否存在非特异性结合，确定IMBS实验所设定的步骤、参数是否有假阳性结果存在。

宿主细胞蛋白（HCP）ELISA定制化开发平台需要具备完善的开发体系，可靠的技术平台，专业的开发团队，以实现长期稳定供应符合法规要求的试剂盒。其中校准品作为关键原材料，其良好的稳定性和溯源保障对生命周期至关重要。为确保校准品的稳定，一般采用冻干工艺制备校准品，用单因素方差分析方法对校准品进行均一性评估，采用法规规定的蛋白定量方法进行校准品的赋值，并溯源至国家标准品（如有）或BSA国家标准品。其次，由于HCPs是复杂的多分析物，为制备尽可能高覆盖率的抗体，覆盖工艺下特有的高风险HCPs，需采用可靠的免疫策略。得到符合性能要求的抗体后，需采用经过验证的可靠的2D或LC-MS方法进行抗体覆盖率的表征，以确保抗体可以充分覆盖各实际工艺下产生的HCPs。得到了具有代表性的抗原和性能优良的抗体后，便是ELISA检测体系的开发，主要包括原辅料的筛选和制备研究、各组分工艺及反应体系研究、稳定性研究等。在检测体系开发完成后，需要根据ICH及药典要求进行分析方法验证的评估，以确保整个检测体系的线性、范围、检测限、定量限、准确度、精密度、专属性以及耐用性等可以满足法规要求。

美国药典USP通则<1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry（质谱法测定生物药中残留宿主细胞蛋白）主要介绍了LC-MS技术在宿主细胞残留蛋白检测中的应用，从样品制备、质谱测试条件的建立、数据的分析、质谱方法验证等多个方面，详细阐述了质谱技术在HCPs中应用的优势与注意事项。作为一种先进的分析技术平台，质谱技术在HCPs分析中的应用，以及与ELISA方法和其他分析方法结合使用，有助于生产企业在产品的整个生命周期中更好地理解和建立HCPs的检测方法，保证产品质量的稳定。

宿主细胞蛋白来源中往往同时存在核酸，胞膜脂类，培养基中的氨基酸等非HCP成分会干扰总蛋白的检测准确性，需要在检测之前进行纯化前处理，同时对总蛋白检测方法进行方法学确认。HCP是一种多蛋白质的混合物，总蛋白定量方法之间检测结果会存在一定程度的差异，这也是导致HCP免疫检测方法结果差异的原因之一。若HCP蛋白定量方法间检测结果差异较大，一般同时采用2种以上经过确认的方法检测，再取均值。总蛋白检测方法的定量限一般只能达到μg/mL水平,但是HCP检测试剂盒的产品校准品在ng/mL水平。从HCP高浓度原液稀释到低浓度产品校准品中存在稀释误差，需要对产品校准品进行重新标定赋值。

为了更好地控制工艺和保证产品质量的稳定，各国监管机构均要求提供使用的宿主细胞蛋白残留检测ELISA试剂盒的抗体覆盖率数据。一般需进行覆盖率分析的场景一般有以下几种情况：①临床II期后，若是继续使用商品化试剂盒，则需要评估试剂盒抗体覆盖率是否可以继续用于质量监控；②临床III期及以后阶段，产品研究者开发了平台化或工艺专属型的HCP监测方法，该类试剂盒在使用前要评估覆盖率水平与商业化覆盖水平的差异；③申报时没有提交覆盖率数据，监管机构可能会对企业提出发补的要求；④产品上市后发生了包括生产场地变更，工艺变更，HCP分析方法变更等因素的变更，研究者则需要评估变更前后抗体覆盖率水平的差异，以及该差异对药品质量与安全带来的影响。