江苏重组蛋白热原检测技术服务

基于单核细胞系的稳定性，MAT 热原检测可将复孔数从药典要求的≥4 降至≥3。PyroSHENTEK®热原检测试剂盒数据显示，单核细胞系标曲的 4 复孔与 3 复孔，各浓度点（0.0125-1.0EU/mL）的准确度（相对偏差）与精密度均在标准范围内，无明显差异。这一调整的主要依据是单核细胞系消除了 PBMC 的异质性，无需依赖多复孔抵消波动，既能满足热原检测的稳定性与统计学合理性要求，又能减少试剂与耗材消耗，降低检测成本，同时提升实验效率。因此样品预测试时可选择3复孔进行初步检测，产品放行还需按照药典要求进行4复孔测试。

热原是能引发恒温动物体温异常升高的物质总称，主要成分为细菌内毒素（革兰氏阴性菌脂多糖 LPS），同时涵盖病毒、真菌毒素、支原体等非内毒素热原，其检测是保障药品与医疗器械安全性的关键环节。当前热原检测已形成 “特异性检测 + 广谱筛查” 互补的完整体系：以鲎试验法（含天然 LAL 与重组 rCR/rFC 试剂）作为细菌内毒素的特异性检测手段，凭借 fg 级灵敏度成为制药行业常规质控方法，可通过凝胶法实现定性、动态浊度 / 显色法完成定量；以家兔热原试验作为传统广谱筛查方法，虽操作繁琐（需预试筛选基础体温稳定家兔，正式试验观察 3 小时体温变化），但仍是放射性质的药物、血液制品等高风险产品排除非内毒素热原的补充手段；以单核细胞活化反应测定（MAT）作为新兴全热原检测技术，利用人源单核细胞（如 THP-1 细胞）释放 IL-6、TNF-α 等细胞因子的特性，可同时识别内毒素与非内毒素热原，契合疫苗、基因治疗产品等对风险控制的需求。三种方法协同应用，从原料入厂到成品放行构建全流程热原防控网络，既保证对内毒素的准确监控，又避免非内毒素热原的遗漏风险。

一次合格的 MAT 法热原检测，需同时满足 “合格标曲” 与 “合格样品检测值及回收率” 两大关键条件。合格标曲需具备四要素：一是良好线性，采用 4-Parameter Logistic 拟合，R² 需接近 1.0，避免线性不佳导致定量偏差；二是良好信号值，各浓度点 OD 值需呈梯度变化，高浓度点 OD 值需足够（如上限浓度 OD600 达 1.0 左右），信号过低会影响灵敏度；三是良好 CV，复孔间 CV 需控制在合理范围（定量限内≤25%、定量上下限≤30%），确保重复性；四是良好背景值，阴性对照 OD 值需低于标曲下限浓度点 10%，排除外源污染。合格样品检测值则需满足加标回收率在 50%-200%，例如文档中某样品 10 倍稀释回收率 41.3%（不合格），20 倍 71.3%（接近合格），40 倍 97.7%（合格），需在 MVD 范围内调整稀释倍数，同时样品热原浓度需低于规定限值（CLC），方可判定样品符合要求。

革兰氏阳性菌注射剂产品只依赖内毒素检测存在安全风险，需结合热原检测特性制定防控方案。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖成分，而革兰氏阳性菌可产生非内毒素热原（NEPs），如脂磷壁酸，这类物质同样能引发人体发热反应，若只检测内毒素，可能遗漏 NEPs 污染，导致临床用药风险。对此，风险评估需重点关注三点：一是建议开展家兔法与内毒素检测的一致性实验，对比两种方法的检测结果，排查是否存在内毒素未检出但家兔法阳性的情况；二是采用 MAT 法热原检测，其通过单核细胞活化机制，可同时识别内毒素与 NEPs，若 MAT 法检测阳性，需进一步追溯 NEPs 来源；三是若无法排除 NEPs 风险，必须按药典要求补充热原检测（如 MAT 法或家兔法），而非只依赖内毒素检测。尤其对于新药或工艺变更后的产品，需通过多方法验证，确保热原检测覆盖所有潜在致热物质，保障临床用药安全。

MAT 法热原检测的关键机制是 “热原活化单核细胞 TLR 受体，触发炎症因子分泌”，TLR 受体的全覆盖是保障检测无遗漏的关键。不同热原需活化不同 TLR 受体：最常见的内毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革兰氏阳性菌的非内毒素热原（如脂磷壁酸）需活化 TLR2/6，真菌多糖活化 TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 试剂盒配套细胞需具备全覆盖的 TLR 受体表达—湖州申科生物通过 Western blot 验证，其 HL-60 细胞系表达 TLR1-TLR9，可响应各类热原。为进一步验证覆盖能力，申科用不同非内毒素热原配体（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激细胞，结果显示所有配体均能诱导 IL-6 分泌，且呈良好量效关系，证明试剂盒可检出各类热原。若细胞 TLR 受体覆盖不全（如缺失 TLR2），则无法检测革兰氏阳性菌的非内毒素热原，导致漏检风险，因此 TLR 受体的全覆盖是 MAT 法热原检测的关键技术指标之一。

MAT法热原检测中，非内毒素热原（NEP）对照品设为 “选做”，且试剂盒不默认配备，需结合检测需求灵活使用，背后有明确的设置逻辑。首先，试剂盒开发阶段已通过验证（用多种 NEP 配体刺激细胞），证明其可检出 NEP，后期实验是否加入 NEP 对照，只需根据内部管理要求或专业人员建议确定，无需强制设置；若产品产线明确无 NEP 污染风险（如只使用革兰氏阴性菌原料），可删除 NEP 对照，简化操作。其次，试剂盒不配备 NEP 对照品，是因不同用户需求差异大 —— 部分用户需检测特定 NEP（如脂磷壁酸），部分需检测广谱 NEP，因此提供单独购买选项，用户可按需选择，避免资源浪费。NEP 对照品的主要使用场景包括：一是方法验证阶段，用于确认试剂盒对 NEP 的响应性；二是产品工艺变更后，排查是否引入 NEP 污染；三是欧盟申报时，需证明方法可覆盖 NEP，此时需加入 NEP 对照品并显示阳性结果。若样品检测中 NEP 对照品阳性，而样品检测阴性，可排除 NEP 污染；若样品阳性，则需进一步鉴定热原类型。