重庆干细胞产品支原体检测培养法

抑制物质检测是支原体培养法的关键前置环节，旨在排除供试品中抑制成分对检测的干扰。湖州申科按 USP 标准执行：对供试品进行一次抑制物质检测，若生产方法发生变化可能影响支原体检测结果，需重复该检测。检测通过两组平行实验对比实现：一组培养基加入供试品，另一组不加供试品，同步开展营养特性测试，判断供试品是否含抑制物质。若检出抑制物质，需通过适当方法中和或抵消其作用，例如使用不含抑制剂的底物，或将供试品稀释在更大体积的培养基中，确保支原体能在检测体系中正常生长，避免因抑制成分导致检测结果失真。

取样量的科学设计直接影响支原体检测的代表性与灵敏度，需结合样品总体积、基质特性综合考量。法规建议：产品总体积大于1000mL的按无菌检查法取样，10-1000mL 取总体积的 1%，1-10mL 取 100μL，小于1mL的需采用替代取样方案。实际检测中，取样体积越大，灵敏度越高，但需平衡洗脱液消耗与重复检测需求。此外，支原体兼具胞内胞外生存特性，只检测上清会导致漏检，需采用细胞裂解等处理方式，确保覆盖全部污染靶点，提升检测结果的真实性。

支原体检测 NAT 方法验证需满足全球药典对检测限、专属性、耐用性、可比性等关键指标的要求，且 EP、USP 新草案提出更严格标准。检测限（LOD）方面，EP 要求针对每种支原体确定临界值，需 3 次单独 10 倍梯度稀释、共 24 个检测数据，95% 检出浓度达标；USP 要求标准菌株浓度≤10 CFU/mL 或 100 GC/mL，≥24 次检测数据支持统计分析；ChP 未明确支原体专属要求，但需满足 “微生物检出下限数量” 设定标准。专属性上，EP 建议测试革兰氏阳性菌交叉污染，USP 要求生信分析与实际样品验证结合，ChP 强调外来成分不干扰试验。耐用性方面，EP 需验证试剂浓度、提取与反应程序变化，USP 涵盖设备、反应体系等参数波动。可比性上，EP 要求 NAT 法与药典法 LOD 及特异性对比，替代培养法需达 10 CFU/mL，替代指示细胞法需达 100 CFU/mL，USP 则视样品基质情况要求可比性研究。

湖州申科构建了覆盖全领域、全场景的支原体检测一站式合规解决方案。产品矩阵丰富，包括支原体 DNA 提取纯化试剂盒（2G）、检测试剂盒（2G，PCR - 荧光探针法）、DNA 校准品、一体化检测卡盒、外源因子全自动核酸分析系统，以及 10 余种支原体验证菌株（已上市猪鼻、肺炎、口腔支原体等，即将上市发酵、精氨酸支原体等）。方案具备极强的场景适配性，可应对 5% 人白、高浓度细胞等复杂基质样品，支持从起始材料到终产品的全流程检测，满足细胞疗法、抗体、疫苗、CRO/CDMO 等不同领域的检测需求。服务层面，提供从方法学建立、样品检测、适用性验证、传统法与 qPCR 法比对到特殊菌株定制的全流程技术支持，配合企业完成监管机构现场审计，满足企业从 IND 到 BLA/NDA 的申报需求，实现 “极简操作、一步加样、避免污染、全量检测” 的价值。

支原体 NAT 检测的特异性验证面临主要挑战：需设计覆盖多种支原体的 PCR 引物，而覆盖范围越广，越可能因支原体与革兰氏阳性菌的系统进化相关性，出现交叉检测现象，影响结果准确性。因此，特异性验证需重点排查非目标微生物的干扰，确保检测结果的专一性。稳健性验证同样关键，需证实检测方法在人为引入的微小参数变化（如反应温度、试剂浓度波动等）下，仍能保持结果稳定，避免因实验条件差异导致的检测偏差。这两项验证直接决定了 NAT 方法在不同实验室、不同操作场景下的适用性，是其获得法规认可的重要前提。

阴性翘尾是支原体 NAT 检测中常见的异常现象，表现为 NCS 或 NTC 出现扩增信号，Ct 值多在 35~40 之间，需科学评估并处理。首先考虑污染因素，可能是阴性对照被阳性样本、试剂或环境气溶胶污染，建议立即复测，复测时使用带滤芯低吸附 TIP 头，严格执行阴阳性分区操作，注重细节防控。其次需排除背景信号等非典型性扩增的干扰，避免误判为污染。若前期验证中频繁出现 NTC 或 NCS 扩增，且已彻底排除污染可能性，可结合已有实验数据重新设置 Cut off 值，确保阈值线能有效区分真实阳性与背景信号，满足实验室检测需求。